La diminuzione del flusso del cuore sinistro negli agnelli fetali causa ipoplasia del cuore sinistro e pro

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 770 (2023) Citare questo articolo

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Il basso flusso sanguigno attraverso il cuore sinistro del feto viene spesso ipotizzato come un'eziologia della sindrome del cuore sinistro ipoplastico (HLHS). Per indagare se una diminuzione del flusso cardiaco sinistro provoca un fallimento della crescita, generiamo un'ostruzione dell'afflusso ventricolare sinistro (LVIO) in agnelli fetali a metà gestazione impiantando bobine nel loro atrio sinistro utilizzando una tecnica percutanea guidata da ultrasuoni. Un LVIO significativo riepiloga importanti caratteristiche cliniche dell'HLHS: diminuzione del flusso della valvola aortica anterograda, perfusione retrograda compensatoria del cervello e dell'aorta ascendente (AAo) dal dotto arterioso, grave ipoplasia del cuore sinistro, un ventricolo sinistro che non forma l'apice e uno strato endocardico ispessito. Gli AAo ipoplastici hanno coppie di geni miRNA che annotano la proliferazione cellulare che sono espressi in modo inverso in modo differenziale dall'RNA-seq in massa. L'RNA-seq a nucleo singolo del miocardio ipoplastico del ventricolo sinistro mostra un aumento dei fibroblasti con una diminuzione reciproca delle proporzioni dei nuclei dei cardiomiociti. Fibroblasti, cardiomiociti e cellule endoteliali del miocardio ipoplastico hanno una maggiore espressione della componente della matrice extracellulare o dei geni della fibrosi con segnalazione disregolata del fattore di crescita dei fibroblasti. Pertanto, una riduzione grave e sostenuta (circa 1/3 della gestazione) del flusso del cuore sinistro del feto è sufficiente a causare un'ipoplasia del cuore sinistro. Ciò è accompagnato da cambiamenti nella composizione cellulare e nell'espressione genica coerenti con un ambiente pro-fibrotico e un'induzione aberrante di programmi mesenchimali.

L'ipoplasia del ventricolo sinistro (LV) è una componente di molte forme di cardiopatia congenita. Nella sua forma più grave, la sindrome del cuore sinistro ipoplastico (HLHS), tutte le strutture del cuore sinistro sono minuscole e non possono supportare la circolazione sistemica. Nonostante la chirurgia ricostruttiva, gli esiti clinici per l'HLHS non sono ottimali: sopravvivenza del 64% o 74% a 1 anno1 e del 59% o 64% a 6 anni2, a seconda del tipo di intervento chirurgico. Solo circa il 50% dei pazienti affetti da HLHS raggiunge i 18 anni di età e nella prima età adulta deve affrontare molteplici sfide, inclusa l'insufficienza cardiaca3.

L'eziologia dell'ipoplasia del ventricolo sinistro rimane incerta ed è probabile che sia eterogenea. In alcuni feti, l'ipoplasia del ventricolo sinistro può diventare evidente dopo il completamento della cardiogenesi, caratterizzata dalla chiusura del setto ventricolare alla 9,1 settimana di gestazione umana (stadio Carnegie 22). Nel contesto specifico della HLHS, l'insorgenza post-cardiogenesi di un deficit di crescita del ventricolo sinistro è supportata dall'osservazione che si riscontra un setto ventricolare intatto nel modello anatomico più comune della HLHS (stenosi o atresia delle valvole aortica e/o mitrale)4, 5,6, e che la progressione della stenosi aortica fetale grave a HLHS è stata ripetutamente documentata nel secondo o terzo trimestre di gravidanza7. La conseguenza emodinamica della chiusura del setto ventricolare è che il riempimento del ventricolo sinistro fetale diventa più precario: dipende interamente dal flusso attraverso la valvola atrioventricolare sinistra e non può più essere compensato dal flusso attraverso il setto ventricolare.

Si è ipotizzato che le forze emodinamiche svolgano un ruolo nell'eziologia della HLHS e modelli animali hanno dimostrato che il flusso sanguigno influenza lo sviluppo e la crescita delle strutture cardiovascolari. Una diminuzione del 70% del flusso dell'arteria carotide di coniglio nell'arco di 2 settimane ha comportato una diminuzione del diametro endotelio-dipendente che era resistente alla vasodilatazione8. Negli embrioni di pesce zebra, l'ostruzione dell'afflusso o del deflusso ventricolare ha avuto effetti profondi sulla morfogenesi del cuore, inclusa la formazione della valvola e la differenziazione delle camere; un fallimento della crescita distale è stato attribuito a forze di taglio inferiori sulle cellule endocardiche9. Negli embrioni precoci di pulcino, la legatura unilaterale della vena vitellina ha provocato malformazioni strutturali delle arterie dell'arco faringeo e del cuore10,11,12. Il difetto cardiaco risultante, più comunemente un'anomalia del setto ventricolare o delle valvole semilunari, dipendeva dall'entità della riduzione del flusso13. Negli embrioni di pollo più vecchi dopo la cardiogenesi, l'ostruzione dell'afflusso del cuore sinistro ha comportato una diminuzione della crescita del cuore14.

0.88 for AAo and >0.91 for LV). We also noticed between-sample variation, which may outweigh effects from the coiling for some samples (Fig. S6) and may be related to some samples having low RNA integrity numbers (RIN). After removing outliers, we identified 64 significantly upregulated, and 85 downregulated genes in AAo (Figure S7a; upregulation refers to higher expression in coiled fetuses). Pathway analyses of significantly differentially expressed genes revealed enrichment for cellular components of the cell periphery (p = 0.022) and plasma membrane (p = 0.029; Supplementary Data 1). Additionally, we identified 4 upregulated miRNAs in AAo (Fig. S8a). For three of those miRNAs, we found significantly downregulated target genes (Fig. S8b), including genes involved in cell growth and proliferation (DDIT4, HS6ST2) and cell adhesion (NRXN3, IGFS3, HS6ST2). For the LV, we discovered 4 significantly upregulated, and 13 downregulated genes (Fig. S7b), enriched for brown fat cell differentiation processes. We also identified 4 upregulated and 7 downregulated miRNAs (Fig. S9a). Among the top upregulated miRNAs was miR-15a-5p. In mice, overexpression of miR‐15 family members was associated with cardiomyocyte cell cycle withdrawal and smaller heart size33. Two upregulated miRNAs had significantly downregulated target genes, and three downregulated miRNAs had significantly upregulated target genes (Fig. S9b). Additional “novel” miRNAs in AAo and LV could not be matched with their respective orthologues and were therefore not evaluated. While the low RIN values necessitate cautious interpretations, we found differentially expressed miRNAs and target genes associated with cell growth, proliferation and adhesion. However, we could not attribute changes to specific cell types or biological pathways./p>

1 and false discovery rate (FDR)-adjusted p-value < 0.05). Briefly, small RNA-seq reads had adapter sequences trimmed with the BBMap suite to keep reads with fewer than 23 nucleotides after trimming. Reads were aligned to the OviAri4 genome and Oar_v4.0 annotation using miRDeep2./p> 1, FDR-adjusted p-value < 0.05; Supplementary Data 1) for treatment – control within each tissue using DESeq2 (v 1.30.1)63. Shrunken log2FCs were calculated with “normal” shrinkage estimator. Mature sequences of DE novel miRNAs were used to identify known miRNA homologs based on sequence similarity in other species with “Single sequence search” function on miRBase (v22.1) with SSEARCH search method./p>

5 and UMAP_2 < 6. We measured pseudotime trajectories with Slingshot74, with stretch = 0 and extension = “n”. We used clusters 10, 2, and 15 as the start clusters for the cardiomyocyte, fibroblast, and endothelial clusters, respectively. First, we removed genes that were not designated with a gene symbol. We then used the tradeSeq75 package to estimate the minimum number of appropriate knots with the “evaluateK”75 function before fitting a negative-binomial general additive model (nb-GAM) for each gene with the “fitGAM”75 function. The 5,000 most variable genes also had nb-GAM’s fitted in each condition to allow for differences in expression between conditions along pseudotime. We identified genes whose expression is associated with pseudotime using the “associationTest” function75, and genes that were differentially expressed between conditions using the “conditionTest”. We corrected p-values returned with these functions using a false-discovery rate (cut-off: FDR-adjusted p-value < 0.05). We then generated pseudotime heatmaps of associated and differentially expressed genes by predicting smoothers for each gene using the “predictSmooth”75 function. Smoothers were scaled and then plotted with the pheatmap function. We completed pathway enrichment of these associated and differentially expressed genes using the following command:76 gprofiler(genes,”hsapiens”, ordered = TRUE, src_filter = c(“GO:BP”, “REAC”, “KEGG”), custom_bg = detected_genes, correction_method = “fdr”)77 and plotted with ggplot2./p>

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